本生闡述——ELISA試劑盒檢測組織勻漿液有哪些注意事項

　　介紹

　　酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)作為最快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的定量分析方法之一，組織樣本的處理和數(shù)據(jù)的處理方式對于ELISA實驗的成功有著非常重要的作用。ELISA檢測的樣本類型不僅包括常見的血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清，而且包括不常見的尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、精ye、陰道分泌物等。其中組織勻漿、細(xì)胞裂解液、糞便、精ye等樣本的收集時間、處理方法和保存的差異，會造成獲得樣品間的蛋白含量差異較大，進而造成后續(xù)檢測或數(shù)據(jù)處理上的一些問題，從而會影響到學(xué)者判斷ELISA實驗的結(jié)果。下面我們著重介紹一些比較通用的組織勻漿液的制備方法，并通過文獻進行列舉數(shù)據(jù)處理的方法，以供大家學(xué)習(xí)借鑒。

　　玻璃勻漿器組織勻漿液的制備方法

　　用4℃預(yù)冷的1×PBS(pH7.2-7.4，0.01M，cell culture)沖洗組織，去除殘留血液，并去除組織上的筋膜、脂肪等冗余組織;

　　稱重后將組織用眼科剪刀和鑷子剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:5-1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)5-9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，不建議反復(fù)凍融超過2次。因為過多的反復(fù)凍融可能影響細(xì)胞因子含量的穩(wěn)定性。最后，將組織勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測;

　　處理樣本的過程就是收集細(xì)胞因子或目標(biāo)蛋白的過程，由于細(xì)胞因子或蛋白結(jié)構(gòu)容易改變和降解，組織勻漿過程完成后，儲存也非常重要，特別需要注意的是，不要反復(fù)凍融，樣本處理之后可分裝密封保存，4度保存應(yīng)小于1周，-20 度不應(yīng)超過3個月，-80度不應(yīng)超過6個月。在標(biāo)本使用前應(yīng)室溫緩慢均衡溶化，不能進行加熱。

　　超聲組織勻漿液的制備方法

　　提前將剪刀、鑷子用75%酒精消毒，然后用預(yù)冷的1×PBS滌浸泡，用來剪切、剪碎組織;

　　對應(yīng)將要提取蛋白的組織編號，然后給EP管編號，放在冰上進行預(yù)冷。用預(yù)冷的PBS (0.01M，pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎;

　　配置裂解液：提前將蛋白酶抑制劑(貨號：P6730)、磷酸酶抑制劑(貨號：P1260)、PMSF(貨號：P0100)分別按照1:100的體積比加入到RIRP裂解液中，快速搖勻后靜置冰上即可;

　　將剪碎的組織，加入對應(yīng)體積的裂解液(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的裂解液，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄);

　　在冰上，用剪刀將組織剪碎(剪至組織顆粒非常細(xì)小，甚至剪成糜狀物)，然后去超聲破碎即可。(超聲的條件：儀器：新芝 Scientz-IID;破碎條件：180W超聲3s關(guān)6s，超聲一次時間1min，超聲3-4次);

　　超聲破碎完成后，離心(4℃，12000rpm離心30分鐘);

　　離心完成后，用移液器吸取上清液至新的EP管中，同時記錄蛋白提取液的體積，然后用BCA法測上清蛋白的濃度。

　　組織勻漿液的蛋白定量必要性

　　為了避免假陽性的產(chǎn)生ELISA檢測指標(biāo)眾多，某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦組織等，因為細(xì)胞內(nèi)含有的蛋白復(fù)雜多變，可能會造成與檢測指標(biāo)有假陽性反應(yīng)。所以通過蛋白含量檢測，把高濃度(20mg/mL以上)的樣本進行稀釋至1-2mg/mL，進行判斷是否存在假陽性的可能;

　　為了方便后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和比較分析

　　因為組織塊的大小、提取蛋白的效率不同，所以必然提取的組織勻漿液中蛋白含量在一定的范圍內(nèi)變化，或者樣本間蛋白含量差異顯著。這些都會造成后續(xù)數(shù)據(jù)處理的困難，無法分辨是因為研究處理的影響，還是蛋白含量造成的差異性。因此，大多數(shù)學(xué)者會繼續(xù)發(fā)掘數(shù)據(jù)的其余方面，例如，處理組與對照組的含量百分比;每克組織勻漿蛋白中細(xì)胞因子含量的比較;聯(lián)用其余指示性指標(biāo)進行比較，例如，炎癥反應(yīng)級別、脂肪率、模型差異等進行聯(lián)合比較分析。

　　組織勻漿液進行細(xì)胞因子檢測的思考

　　因為目前檢測細(xì)胞因子的類型越來越多，我們也要重新考慮樣本處理適合自己的樣本類型，并且適合自己檢測的細(xì)胞因子類型，例如，檢測因子有可能為蛋白酶3(Protease 3)、核糖核酸酶A(核糖核酸酶A)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE/ELA2)等具有酶活性質(zhì)的細(xì)胞因子，在組織勻漿過程中是否添加蛋白酶抑制劑就值得思考;

　　一些檢測細(xì)胞因子需要酸化激活處理也需要特別注意，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、肌肉生長抑制素(GDF-8)等，因此在組織勻漿液的pH最好處于6.5-7.5的中性范圍;

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